一、原代培養(yǎng)及其操作步驟

原代分離細胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后，經(jīng)機械以及消化分離成單個細胞或單一型細胞群，使之在體外模擬人體生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定的營養(yǎng)條件下，生存、生長和繁殖。原代培養(yǎng)細胞常有不同的細胞成分，生長緩慢，但是更能代表所來源的組織細胞類型和表達組織的特異性特征。利用原代細胞培養(yǎng)做各種實驗，如藥物測試、細胞分化及病毒學(xué)方面的試驗效果很好。其操作步驟如下。

1. 剪切組織　先將所取得的組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手術(shù)鑷去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清洗后，用手術(shù)刀將組織切成若干小塊，移入青霉素小瓶或小燒杯中，加入適量緩沖液，用彎頭眼科剪，反復(fù)剪切組織，直到組織成糊狀，約1mm3大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當(dāng)?shù)木彌_液再清洗一次。

2. 消化分離　消化分離的目的是將細小的組織塊消化分離成細胞團或分散的單個細胞，以利于進一步的培養(yǎng)，常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。

3. 培養(yǎng)　細胞懸液用計數(shù)板進行細胞計數(shù)。用培養(yǎng)液將細胞數(shù)調(diào)整為（2～5）×105 cells／ml，或?qū)嶒炈杳芏?，分裝于培養(yǎng)瓶中，使細胞懸液的量以覆蓋后略高于培養(yǎng)瓶底部為宜。置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5％CO2，37℃靜置培養(yǎng)。一般3～5d，原代培養(yǎng)細胞可以黏附于瓶壁，并伸展開始生長，可補加原培養(yǎng)液量1／2的新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d后換液，一般7～14d可以長滿瓶壁，進行傳代。

4. 注意事項

（1）無菌操作：細菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗的常見原因，必須加強各個環(huán)節(jié)的無菌操作觀念，以預(yù)防為主，一旦污染，一般很難消除。

（2）培養(yǎng)液：所用的培養(yǎng)液必須滿足細胞生存和生長的必要條件。由于細胞來源的動物種類、組織類型不同，對培養(yǎng)液的要求有一定的差異，必要時可用預(yù)實驗的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液。

（3）小牛血清：小牛血清對于維持培養(yǎng)細胞的生存和促進細胞增殖起著關(guān)鍵性作用?？蛇x擇多種不同批號的小牛血清進行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號小牛血清后，就保持應(yīng)用至實驗完成。

（4）膠原酶溶液：必須新鮮配制，貯存時間過長(即使是-20℃低溫保存)，也將影響消化效力，導(dǎo)致消化時間過長，細胞損傷增加。

（5）L-谷氨酰胺：幾乎所有細胞對谷氨酰胺都有較高的要求，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時，細胞會因生長不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱貯存兩周以上時，就應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。

（6）靜置培養(yǎng)：原代細胞在消化分離后，置于CO2培養(yǎng)箱的頭24～48h (必要時72h)內(nèi)，應(yīng)處于絕對靜置狀態(tài)，切忌不時地取出培養(yǎng)瓶觀察生長狀況，這將使原代分離細胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖，初學(xué)者尤應(yīng)注意。不必擔(dān)心培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分會消耗光，在細胞增殖之前對營養(yǎng)的要求并不大。原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培養(yǎng)液的目的也在于有利于細胞貼壁伸展。

（7）消化時間：一般消化至肉眼尚可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已經(jīng)松散，略經(jīng)吹打即成細胞團或單個細胞，過久的消化往往導(dǎo)致細胞損傷加重，細胞培養(yǎng)成活率降低。

（8）其他生長因子：經(jīng)過以上處理，一般原代分離細胞培養(yǎng)均可以成功。對于少數(shù)特殊類型細胞也可以考慮加一些特殊的生長因子，如胰島素能促使細胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外，內(nèi)毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費用較高。

二、傳代培養(yǎng)及其操作步驟

原代細胞培養(yǎng)成功以后，需要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細胞允許培養(yǎng)的細胞擴增(形成細胞株)，可以進行細胞克隆，易于保存，但可能喪失一些特殊的細胞和分化特征。傳代細胞形成細胞株的最大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于實驗。

1. 操作步驟

（1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

（2）向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。

（3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化。

（4）吸出消化液，向瓶內(nèi)加入Hanks液少量，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

（5）使用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。

（6）用計數(shù)板計數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

（7）細胞培養(yǎng)換液時間應(yīng)根據(jù)細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2～3d后應(yīng)換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。

2. 注意事項

（1）掌握好細胞消化的時間，消化時間過短時，細胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導(dǎo)致細胞脫落、損傷。

（2）掌握好消化濃度，當(dāng)消化液濃度過高時，消化時間應(yīng)縮短，過低時細胞消化時間相對延長。

三、體內(nèi)細胞培養(yǎng)及其操作步驟

1． 瘤細胞懸液接種

（1）無菌選取生長良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細胞。

（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過濾成細胞懸液。

（3）培養(yǎng)細胞應(yīng)用PBS洗兩遍。

（4）計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至107～108／ml。

（5）常規(guī)消毒后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml／部位，＞106細胞)。初次接種成功率低，細胞數(shù)盡可能多一些。

（6）次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短，最后固定為一個相對穩(wěn)定的時間。

2． 腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實體瘤細胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤細胞，將這種腹水反復(fù)傳代，即可成為腹水瘤。初次傳代時，腹水常呈血性(含大量紅細胞)，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下。

（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細胞離心和洗滌，進行細胞計數(shù)。

（2）消毒動物，左下腹穿刺接種106腹水瘤細胞。

（3）接種腹水瘤細胞后約7~12d，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。

（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min，收集上清，分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

四、培養(yǎng)細胞的凍存及復(fù)蘇

細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。

1． 凍存細胞

（1）選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。

（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液，計數(shù)，使細胞密度達5×107／ml左右密度，離心，去上清。

（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點降低，使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外。

（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。

（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標(biāo)記。

（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內(nèi)，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內(nèi)水分透出，太慢則促進冰晶形成。

操作時應(yīng)戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。

2. 復(fù)蘇細胞

（1）從罐中取出凍存管。

（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成。

（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。

（4）低速離心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。

（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。

凍存細胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達到107／ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×105／ml數(shù)量