MET-5A 人膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)

貨號(hào)：WS0397H

規(guī)格：1×10?cells/T25培養(yǎng)瓶

細(xì)胞特性

1） 來(lái)源：間皮

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)

3） 含量：>1x10^6  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

細(xì)胞處理：

凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mLwan全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8mlwan全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的wan全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

一、細(xì)胞培養(yǎng)的原理

細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無(wú)菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件等），使之生存、生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。

細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；直接從體內(nèi)獲取的組織細(xì)胞進(jìn)行shou次培養(yǎng)為原代培養(yǎng)；當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要傳代培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，從一個(gè)容器以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器（同樣底面積的容器）中擴(kuò)大培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞的代數(shù)，腫瘤細(xì)胞系一般不超過(guò)50代。因此需要在每一次傳代后，標(biāo)記清楚（如P10，代表傳代了10次）。

二、所需試劑和耗材

1、所需試劑

（1）wan全培養(yǎng)基：一般是用DMEM+10% FBS（胎牛血清，有時(shí)也添加雙/三抗預(yù)防細(xì)胞感染。具體培養(yǎng)基類型根據(jù)細(xì)胞類型選擇。培養(yǎng)基有不同類型，除了DMEM，還有1640等培養(yǎng)基，根據(jù)自己的細(xì)胞使用響應(yīng)的培養(yǎng)基?？梢栽贏TCC查看。

（2）0.25 %胰蛋白酶：簡(jiǎn)稱是胰酶，消化細(xì)胞。一般消化1-2 min，時(shí)間太短，細(xì)胞消化不wan全，時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)消化過(guò)度損傷細(xì)胞。

（3）凍存液：一般用 10% DMSO+FBS+培養(yǎng)基組成，F(xiàn)BS 和培養(yǎng)基的比例依細(xì)胞類型決定，比較珍貴的細(xì)胞一般用 90% FBS + DMSO，一般的細(xì)胞可以用50% FBS+40% 培養(yǎng)基來(lái)配制?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

（4）常用試劑：75% 酒精，PBS緩沖液等。

2、耗材

（1）細(xì)胞培養(yǎng)容器：培養(yǎng)瓶 25、50、250ml 等，培養(yǎng)皿：10cm、6cm，孔板：6孔板、12孔板、24孔板、96孔板等。具體根據(jù)情況進(jìn)行選擇對(duì)應(yīng)的容量

（2）吸管、移液管、凍存管、各種槍和槍頭、離心管、封口膜等。

三、實(shí)驗(yàn)儀器

離心機(jī)、生物安全柜、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、顯微鏡、液氮罐等

MET-5A 人膜間皮細(xì)胞

大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 A7R5

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(低分化) PC-12(低分化)

大鼠β胰島素瘤細(xì)胞 RIN-M5F

大鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元瘤細(xì)胞 VSC4.1

大鼠骨肉瘤細(xì)胞 UMR-106

大鼠腦I型星形膠質(zhì)細(xì)胞 CTX-TNA2

大鼠垂體瘤細(xì)胞 MMQ

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(未分化) PC-12(未分化)

大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病細(xì)胞 RBL-2H3

大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系 OLN-93

大鼠垂體瘤細(xì)胞 GH3

大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞 L6

正常大鼠腎細(xì)胞 NRK-49F

大鼠皮膚成纖維樣細(xì)胞 RS1

大鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞 RLE-6TN

大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細(xì)胞 AR42J

大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞 IEC-6

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 C6

大鼠胚胎心肌細(xì)胞 H9c2(2-1)

大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 DRG

大鼠肝癌細(xì)胞 H4-II-E-C3

大鼠正常肝細(xì)胞 BRL3A

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(高分化) PC-12(高分化)

大鼠空腸膠質(zhì)細(xì)胞 EGCCRL-2690

大鼠雪旺細(xì)胞 RSC96

大鼠腎小球系膜細(xì)胞 HBZY-1

大鼠膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞 9L/lacZ

大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞 INS-1

大鼠肝上皮樣干細(xì)胞 WB-F344

正常大鼠腎細(xì)胞 NRK-52E

大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞 HAPI

小鼠乳腺癌細(xì)胞 AT-3

小鼠肺上皮細(xì)胞 TC-1

小鼠鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 SCC7

小鼠垂體瘤細(xì)胞 AtT-20

小鼠淋巴結(jié)上皮細(xì)胞 SVEC4-10

小鼠胚胎纖維細(xì)胞 STO

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞 TM3

小鼠急性骨髓性白血病 C1498

小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞 MOVAS

小鼠黑色素瘤細(xì)胞 B16

小鼠乳腺癌細(xì)胞 E0771

小鼠樹(shù)突狀瘤細(xì)胞 DC2.4

小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞 RAW264.7

小鼠成纖維細(xì)胞 NCTCclone929

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株 bend.3

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 C3H/10T1/2

小鼠心肌細(xì)胞　 HL-1

小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞 Neuro-2a

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 MEF

小鼠腎小管上皮細(xì)胞 TCMK-1

小鼠單核巨噬細(xì)胞 J774A.1

小鼠胚胎肌母 C2C12

小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞 3T3-L1

小鼠肺泡上皮細(xì)胞 MLE-12

小鼠乳腺上皮細(xì)胞 HC11

小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株 RGC-5

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株 MC-38

小鼠淋巴瘤細(xì)胞(NK靶細(xì)胞) YAC-1

小鼠T淋巴瘤細(xì)胞（雞OVA基因修飾） E.G7-OVA

小鼠正常肝細(xì)胞 NCTC1469

小鼠肺泡巨噬細(xì)胞 MH-S

小鼠肺腺癌細(xì)胞 LA7120

小鼠腎小球足細(xì)胞 mpc-5

小鼠T淋巴細(xì)胞 CTLL-2

小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 MAEC

正常小鼠睪丸Sertoli細(xì)胞 TM4

小鼠淋巴細(xì)胞白血病 L1210

小鼠腹水瘤細(xì)胞 S-180

小鼠雜交瘤（抗CD2）細(xì)胞 OKT11

小鼠小腦細(xì)胞 C8-D1A

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞 MLTC-1

小鼠下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞 GT1-7

小鼠黑色素瘤細(xì)胞 B16-F10

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞 CT26.WT

小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞 L Wnt-3A

小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞 EOMA

小鼠神經(jīng)干細(xì)胞 NE-4C

小鼠胰島β細(xì)胞株 Min6

小鼠B細(xì)胞淋巴瘤 A20

小鼠肝癌細(xì)胞 Hepa1-6

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞 Bv-2

小鼠乳腺癌細(xì)胞 4T1

小鼠胚胎瘤細(xì)胞 ATDC5

小鼠胰腺癌細(xì)胞 PANC02

小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞 GL261

小鼠肺癌細(xì)胞 LLC

小鼠骨肉瘤成骨細(xì)胞 K7M2wt

小鼠乳腺癌細(xì)胞 EMT6

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞 HT22

小鼠小腸內(nèi)分泌細(xì)胞系 STC-1

小鼠乳腺上皮細(xì)胞 EpH4-Ev