豬腎細胞 PK-15

細胞介紹

從分離自新生的未閹割的豬的空腸的正常腸上皮細胞建立，該細胞系攜帶豬C型腫瘤病毒(PCOV)序列及其轉錄物，分別通過PCR和RT-PCR檢測。我們沒有確定這些病毒的感染方式，也不能排除病毒的分泌。在德國，這些病毒被分類為與人有關的BSL 1和與動物有關的BSL 2(TRBA 462)。然而，德國中央生物安全委員會(ZKBS)將這些病毒和受感染的細胞系BSL 2歸類為用于基因改造應用(參考文獻1。6790-10-65).

細胞特性

1） 來源：豬  腸(空腸)

2） 形態(tài)：上皮細胞樣  貼壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5）用途：僅供科研使用。

三、 細胞傳代操作步驟

A. 貼壁細胞傳代

1. 準備：吸棄舊培養(yǎng)基。

2. 沖洗：沿培養(yǎng)瓶側壁緩慢加入PBS等沖洗液，輕輕晃動后吸棄，去除殘留血清。

3. 消化：加入預熱的胰酶（如T25加1ml），輕輕晃動使胰酶覆蓋所有細胞。

4. 孵育：室溫消化約2分鐘（時間因細胞而異）。

5. 觀察：在顯微鏡下觀察，直至≥90% 細胞變圓、脫落。若未達到，可每30秒檢查一次。

6. 終止：當細胞充分解離后，立即加入兩倍胰酶體積的預熱的wan全培養(yǎng)基終止消化。

7. 吹打：用移液器輕輕吹打瓶壁，使細胞wan全脫落并分散成單細胞懸液。

8. 離心：將細胞懸液轉移至離心管，200 × g 離心 3-5分鐘，棄上清。

9. 重懸與接種：用少量新鮮wan全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，按適當比例稀釋后，接種到新的培養(yǎng)瓶中。

10. 培養(yǎng)：放入培養(yǎng)箱。若使用普通瓶蓋，務必旋松瓶蓋以利氣體交換。

B. 懸浮細胞傳代

1. 收集與離心：將細胞懸液全部轉移至離心管，1000 rpm 離心 5分鐘，棄上清。

2. 重懸：加入1-2ml新鮮wan全培養(yǎng)基，輕柔重懸細胞。

3. 接種：按1:2的比例將細胞懸液傳至新T25培養(yǎng)瓶，并補充總培養(yǎng)基量至5-8ml。

4. 培養(yǎng)：放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

四、 特殊問題處理：運輸中脫落的貼壁細胞

部分貼壁不牢的細胞在運輸中會脫落，屬正?，F(xiàn)象，按以下步驟處理：

1. 收集：將瓶內所有培養(yǎng)基轉入無菌離心管，離心（1200rpm, 3-5min）棄上清。

2. 清洗：用PBS重懸細胞，再次離心（1200rpm, 3-5min）棄去PBS。

3. 消化：加入約1ml 0.25%胰酶，輕柔混勻（勿劇烈吹打），放入培養(yǎng)箱消化1-2分鐘。

4. 終止與分散：取出后輕輕吹打使細胞團分散，迅速加入3-5mlwan全培養(yǎng)基終止消化，離心（1200rpm, 3-5min）棄上清。

5. 重懸與接種：加入5mlwan全培養(yǎng)基重懸，按比例接種到新培養(yǎng)瓶/皿中。

6. 觀察：鏡下觀察。若細胞為單顆或僅有3-5個細胞的小團，可正常培養(yǎng)，待其貼壁生長。--細胞凋亡的早期形態(tài)學改變是核染色質濃聚、固縮,聚集在核膜周邊，然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片，細胞膜將胞質和染色質斷片包裹，胞漿內形成多個膜結構尚完整的“小泡"及 “凋亡小體" (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹、胞膜破裂、細胞崩解。

       根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，至今為止，已經(jīng)設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。

流式細胞技術

     流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結構的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強度與細胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強度與細胞結構的析射性、顆粒性（granu-larity）有關。

     細胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變如細胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。

     由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結合起來才能準確地辨認凋亡細胞。

     細胞凋亡過程中核酸內切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。

    根據(jù)此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質比例等方法辨認凋亡細胞。

檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細胞儀分析。

豬腎細胞 PK-15

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豬肺泡巨噬細胞 3D4/21

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