豬腎細(xì)胞系 LLC-PK-1 

DMEM+10%FBS+1%P/S  

貼壁生長

細(xì)胞培養(yǎng)基本知識

體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個體遺傳背 景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施 亦不盡相同，現(xiàn)介紹個別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點如下：

上皮細(xì)胞培養(yǎng)

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞

上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中?；祀s有成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細(xì)胞，并難以純化，同時上皮細(xì)胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關(guān)鍵。體內(nèi)上皮細(xì)胞生長在膠原構(gòu)成的基膜， 因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長， 另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以 3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時，細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低 PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細(xì)胞生長。以表皮細(xì)胞為例， 用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞， 其法如下：

1、 取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊， 早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好， 取角化層薄者， 切成 0.5－1 平方厘米小塊。

2、置 0.02%EDTA 中，室溫，5 分鐘。

3、換入 0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。

4、分離：取出皮塊，用血管或鑷子將表皮與真皮層分開。

5、取出表皮，剪成更小的塊后，置 0.25%胰酶中，37℃，30—60 分鐘。

6、反復(fù)吹打，制成懸液。

7、培養(yǎng)：用 80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。

8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle 加 20%小牛血清）制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2 溫箱培養(yǎng)。

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞，對于研究內(nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便，其法如下：

1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取 10—15 厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于 12 小 時內(nèi)保存于 4℃。

2、用三通注射器吸取溫 PBS 液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊， 以防液體返流。

3、用血管緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為 0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化 3—10 分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，于離心管中，注入溫 PBS 輕輕反復(fù)沖洗后，一 并注入離心管中（此步驟可重復(fù)） 。

5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫 箱培養(yǎng)。兩至三天可見細(xì)胞長成單層。

神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)

神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象， 但很難使之增殖。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長的膠質(zhì)細(xì)胞，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說來，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用 ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。

一．設(shè)備：無菌操作設(shè)備。

二．大型設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱：恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。

倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細(xì)胞生長情況。

解剖顯微鏡：用于準(zhǔn)確地取材。

常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠。

低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。

電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術(shù)器械。

過濾器：配制解剖液、培養(yǎng)液，必須過濾后才可使用，以去除細(xì)菌。

滲透壓儀：pH劑，天平等。

三．培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械

1.培養(yǎng)皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。

2.培養(yǎng)板：24-40孔，可用于開放培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)瓶；

4.吸管：常用1，5，10mL，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。

5.各類培養(yǎng)液貯存器。

6.小型手術(shù)器械。

準(zhǔn)備

一.配制培養(yǎng)液

（1）解剖液：以無機鹽（去除Ca2+, Mg2+ ）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。

（2）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。

（3）接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細(xì)胞分散，做成細(xì)胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當(dāng)天配制。

（4）維持培養(yǎng)液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養(yǎng)物質(zhì)。

二.培養(yǎng)基質(zhì)

常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠。

三.消毒培養(yǎng)皿的備用

所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d，達(dá)兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養(yǎng)前1天進(jìn)行。

神經(jīng)細(xì)胞分散培養(yǎng)

（一）選材

常用胚胎動物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細(xì)胞成活率高，顆粒細(xì)胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。

（二）取材

腦則取出相應(yīng)組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側(cè)，分別培養(yǎng)。

（三）細(xì)胞分離與接種

神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液，計數(shù)，預(yù)置細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應(yīng)為5×105或更低。

（四）抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長

培養(yǎng)3-5d后，也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞

II型肺泡上皮細(xì)胞

氣管上皮細(xì)胞

氣管平滑肌細(xì)胞

支氣管上皮細(xì)胞

支氣管平滑肌細(xì)胞

肺成纖維細(xì)胞

肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞

肺動脈平滑肌細(xì)胞

心肌細(xì)胞

主動脈內(nèi)皮細(xì)胞

心肌成纖維細(xì)胞

心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞

主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞

冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞

冠狀動脈平滑肌細(xì)胞

頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞

頸動脈平滑肌細(xì)胞

食管上皮細(xì)胞

食管平滑肌細(xì)胞

食管成纖維細(xì)胞

胃粘膜上皮細(xì)胞

胃平滑肌細(xì)胞

胃成纖維細(xì)胞

小腸粘膜上皮細(xì)胞

小腸平滑肌細(xì)胞

小腸成纖維細(xì)胞

結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞

結(jié)腸平滑肌細(xì)胞

結(jié)腸成纖維細(xì)胞

膽囊上皮（永生化）細(xì)胞

膽囊上皮細(xì)胞

肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞

肝外膽管上皮細(xì)胞

肝實質(zhì)細(xì)胞

肝星狀細(xì)胞

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞

肝Kuffer細(xì)胞

直腸成纖維細(xì)胞

肝成纖維細(xì)胞

直腸上皮細(xì)胞

直腸平滑肌細(xì)胞

膽囊微血管內(nèi)皮細(xì)胞

膽囊成纖維細(xì)胞

膽囊平滑肌細(xì)胞

膽囊動脈內(nèi)皮細(xì)胞

食管癌細(xì)胞

食管纖維瘤細(xì)胞

腎小管上皮細(xì)胞

腎小球系膜細(xì)胞

腎小球內(nèi)皮細(xì)胞

腎足細(xì)胞

輸尿管上皮細(xì)胞

輸尿管平滑肌細(xì)胞

膀胱上皮細(xì)胞

膀胱平滑肌細(xì)胞

膀胱成纖維細(xì)胞

前列腺上皮細(xì)胞

前列腺成纖維細(xì)胞

輸卵管成纖維細(xì)胞

甲狀腺上皮細(xì)胞

甲狀腺成纖維細(xì)胞

胰腺星狀細(xì)胞

胰島細(xì)胞

腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞

腎上腺包膜成纖維細(xì)胞

扁桃體動脈內(nèi)皮細(xì)胞

扁桃體動脈平滑肌細(xì)胞

腮腺腫瘤細(xì)胞

扁桃體間質(zhì)細(xì)胞

頜下腺囊腫細(xì)胞

甲狀腺微血管內(nèi)皮細(xì)胞

扁桃體上皮細(xì)胞

扁桃體靜脈平滑肌細(xì)胞

扁桃體成纖維細(xì)胞

卵巢間質(zhì)細(xì)胞

輸卵管上皮細(xì)胞

輸卵管平滑肌細(xì)胞

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞

子宮平滑肌細(xì)胞

乳腺上皮細(xì)胞

乳腺成纖維細(xì)胞

乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞

乳腺癌（腫瘤）細(xì)胞

子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞

子宮瘤細(xì)胞

乳腺癌（腫瘤）干細(xì)胞

宮頸成纖維細(xì)胞

宮頸平滑肌細(xì)胞

卵巢囊腫細(xì)胞

宮頸上皮細(xì)胞

精原細(xì)胞  

睪丸白膜上皮細(xì)胞

睪丸白膜成纖維細(xì)胞

輸精管平滑肌細(xì)胞

附睪平滑肌細(xì)胞

附睪管上皮細(xì)胞

附睪成纖維細(xì)胞

宮頸癌細(xì)胞

睪丸支持細(xì)胞

子宮成纖維細(xì)胞

真皮成纖維細(xì)胞

角質(zhì)形成細(xì)胞

前脂肪細(xì)胞

脂肪微血管內(nèi)皮細(xì)胞

真皮毛乳頭細(xì)胞

豬腎細(xì)胞系 LLC-PK-1 

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的 重要對象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì) 胞群，在條件適宜下可生活 2－3 周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。

巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系，大多來自小鼠，如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難 以建株。

培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來源來獲取細(xì)胞， 以小鼠腹腔取材法最為實用， 其法如下：1、實驗前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯 lml（勿注入腸內(nèi)！，以 ） 刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入 70%乙醇中 3－5 秒。

4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁， 把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。

5、用 70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中，同時用手指從 兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動。

6、 用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)． 使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下 250g 離心 10 分鐘后，去上清，加 10ml Eagle 培養(yǎng)基。

9、計數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生 20 一 30×106 細(xì)胞，其中 90%為巨噬細(xì)胞。

10、以 3×105 個貼附細(xì)胞/平方厘米接種。

11、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細(xì)胞，純化培養(yǎng)細(xì)胞，用 Eagle 液沖洗 1 一 2 次，再加新 Eagle 培養(yǎng)液置 CO2 溫箱中。